家喻户晓白丝足交，肝胆、结直肠等腹部肿瘤，尤其是转机性肿瘤的推敲，一经相等相等卷了！但是，大牛老是有我方疏淡的视角！2024年1月，樊嘉院士团队在Cancer Cell IF=50.3，发表题为“整合多组学分析剖解转机性肝细胞癌的时空演化Integrated multi-omics profiling to dissect the spatiotemporal evolution of metastatic hepatocellular carcinoma”著述。

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转机性肿瘤克隆进化+单细胞扫码研讨

这篇樊嘉院士团队新发表的著述，将转机性肿瘤的分析进一步细化，侧重分析比较不同异质性的肝肿瘤原发灶（包括多原发、单原发）各自的肝内、肝外转机接洽基因组特征、克隆进化机制、转机的时向特质；并把柄显赫各异的基因组特征进一步分亚组，基于单细胞转录组数据，进一步解析各异的免疫特征、分子机制；最终鉴定出不错同期阻扰HCC不同类型的转机的靶向药物。

推敲团队麇集了来自手术切除的HCC患者的肿瘤组织样本，并进行了全外显子组测序（WES）、RNA组测序（RNA-seq）和T细胞受体（TCR）测序。进一步分离了肿瘤接洽成纤维细胞（CAFs）和原代肿瘤细胞（PDOs）进行体外和体内实践。通过整合多组学数据来解析转机性肝细胞癌（HCC）的时空演化流程。揭示了HCC的时空演化流程，并探索了与转机接洽的分子机制，为临床疗养提供新的想路和靶点。

一、配景

肝癌是大家癌症圆寂的第三大原因，肝细胞癌（HCC）占大无数病例。多达60%的局限性可切除疾病患者在会诊后5年仍存活，比较之下，迢遥转机患者仅为4%。由于转机在很猛进度上仍无法调理，因此了解这一流程关于改善晚期HCC患者的预后相等紧要。几项大畛域测序责任为驱动HCC发病机制的枢纽遗传和转录流程提供了有价值的主见。，可是，大无数分析是针对原发性肝细胞癌进行的，很少有测序转机。

尽管转机瘤与原发瘤具有共同的枢纽驱动基因篡改或转录方法，但它们在播散和疗养流程中不绝会发展出新的性状。跟着高度异质性原发病灶和可能更均匀的转机的发展，紧要需要通过对匹配的原发性和转机性肿瘤进行测序得回的转机性疾病的详尽遗传和分子景不雅，以讲述生物学基础并详情更有用的HCC转机疗养政策。

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二、效用

1、成对原发性和转机性肝细胞的基因组图谱

肝外转机组（MET组，n=335个区域）包括78例患者的成对原发肿瘤（PTs）、肝内复发性肿瘤（RTs）和肝外转机性肿瘤（MTs），无复发/转机组（NRM组）包括31例术后无复发或转机的患者（≥6年）。

里面考据部队包括65例具有不同临床效用的未配对PT患者，外部考据部队包括来自天津医科大学肿瘤推敲所和病院的8例PT和MT配对患者（图1A；S1A）。

使用全外显子组测序（WES）和/或RNA测序（RNA-seq）对整个区域进行分析。其中，MET组52.3%的PTs和MTs为多区域测序（图S1B）。MET组的转机具有频频的时空表征，包括原发性HCC手术后0-67个月出现的9个不同的转机部位（图1B，1C和S1B）。

使用Mutect2对整个肿瘤区域进行单核苷酸变异和小插入缺失（Indels）检出。落寞的Sanger测序证实了>95%的代表性突变检出来自WES（图S1D）（图S1E）。

把柄癌细胞分数以及它们在多采样区域中的存在来差异克隆或亚克隆突变。MutSigCV鉴定检会部队中整个PT的8个常见突变基因，并分析与TCGA数据PT中HCC驱动基因的突变率相似性（图S1F）。

专注于克隆突变，以鉴定MT中反复突变的基因，三个抑癌基因被鉴定为MTs中显著复发的突变：TP53（32/72），RB1（11/72）和PTEN（7/72）；，使用Sequenza和Gistic推断体细胞拷贝数篡改（SCNA），在PT和MT中不雅察到的频频和局灶性复发性SCNA阵势（图1D)。

总而言之，该推敲不雅察到的MT中高度频频突变和SCNA的特征和先前推敲中的PT高度一致。

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2、跟踪肝癌转机的克隆发源

为了跟踪MT的克隆发源，使用Treeomics重建了团结患者体内整个测序肿瘤的系统发育和PTI；重心矜恤三种：多灶性PT、RT和MTs以及多发性MT患者。

约莫41%-75%的HCC病例在临床上被会诊为多灶性PT，30%的多灶性PT是多中心（即遗传上不同的发源）。在作家的部队中，在6例多灶性PT患者中有2例不雅察到多中心PT（图S2A）。标明MT更有可能由一个多中心HCC谱系播撒。

在肝细胞癌中，放疗可分为遗传相似的肝内转机（IM）和遗传上不同的多中心发生（MO）。可是，IM-RT和MO-RT谱系或只好一个谱系是否不错动作转机源仍然未知（图S2C）。

将整个16个RT分为IM-RT（n=11）和MO-RT（n=5）。莫得一个MTs来自MO-RTs（图S2C）。比较之下，在IM-RTs患者（n=7）中，71%的MT由IM-RTs而不是PTs接种（图S2D）。在患者M021中，通顺发生了三次落寞复发（图2B）。前两次复发（RT1和RT2）被指定为IM-RT，而第三次复发（RT3）被指定为MO-RT。进化轨迹分析标明，骨转机发源于IM-RT谱系（RT1/RT2），而非MO-RT谱系（RT3）。相通，患者M048中遗传不同的MO-RT莫得种子转机（图2C）。这些效用标明，MO-RT谱系的转机才调弱于IM-RT谱系，与MO-RT的较好预后一致。

MTs也可能播撒新的迢遥病变，系统发育分析标光线续的MTs倾向于由PT播撒，而不是早期的MTs。可是，一些病例标明，转机细胞不仅播散到不同的器官，而且还在原始器官中自行播撒（图2C-2D）。

总之，效用标明肝外转机所以单谱系面目播撒的，来自该谱系的任何阶段的肿瘤（PT、IM-RT或MT）皆可能是潜在的起头（图2E）。

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图S2

3、HCC转机性播散阵势的特征

癌症转机不错通过单个亚克隆（单克隆播撒）或多个不同的亚克隆（多克隆播撒）播撒。在这项推敲中，在39例多区域采样MT（n=43个肿瘤）和配对PTs/RT的患者中，10/43个MT（23%）由来自PTs/RT的多个不同亚克隆接种（图3A）。转机性播撒阵势与MT大小或全身疗养无接洽性（图S3A）。

分析单克隆和多克隆播撒是否与不同的临床疾病进展率接洽。33例患者术后出现异时性转机，进一步分为两亚组：快速进展（多部位疾病进展<12个月手术）或削弱进展（单部位进展<12个月或多部位进展>12个月）。多克隆接种患者进展赶紧，而单克隆接种与进展削弱接洽（图3B）。

生涯分析标明，转机性播撒阵势是总生涯期的紧要预后因素（图3C和S3B）。

发展多克隆MTs的PT的基因组和转录组学特征。GSEA凸起了多克隆接种PT中缺氧信号转导的转录激活（图3D和S3C），并通过了IHC染色考据（图3E，3F和S3D）。

为了考据缺氧信号增强与多克隆之间的假设因果接洽，进行体内细胞搀杂实践（图3G和S3E）。随后对肺转机的分析标明，HIF1A-KD细胞在多色病变的发展中发达出统计学上的显著减少白丝足交，HIF1A-OE细胞的多色转机显著加多（图3H和3I）。

总而言之，多克隆接种与较差的预后接洽，况且缺氧方法可能有助于HCC的多克隆播散。

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图3

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图S3

4、PT和MT之间的基因组各异辅导早期转机播散

近期的推敲检会转机性播散可能在多种癌症类型的早期运转，但肝细胞癌转机播散的时分尚不了了。

克隆突变分为PT-private、MT-private和sharedmutations；PT-private突变计数显赫高于分享突变和MT-private突变计数（图4A；A）。

为了模拟转机性播散的时分法例，作家开发了一个基于配对PT和MT之间基因组异质性进度的模子（图4B)。

转机性前体的早期出现被界说为0<R∗≤0.5，晚期传播为0.5<R∗<1.0（图4C）。在检会和外部考据部队中，大无数MT早期从PT传播（图4D）。SCIMIT系列还展望早期转机占病例的>80%（图S4B）。

在检会部队中，还不雅察到肝内转机的早期播散占主导地位（图S4C）；此外，早期出现的MTs发达出彰着的亚克隆突变，这也救援了它们的早期转机接种（图4E）。

进一步探讨了传播时机与临床参数之间的关联。遗传界说的晚期播散在经腔转机中更常见（图4F）。转机的时分与同步转机或PT的大小无关（图S4D）。

鉴于PT和MT之间的高度遗传各异，进一步推敲它们是否具有共同的可成药靶点。将整个传递的变异映射到临床属目数据库（CIViC、DGIdb的，和药物银行）和HCC接洽成药基因。与分享突变比较，在MT-private和PT-private突变中不雅察到更多的潜在药物靶点（图4G)。

总而言之，这些效用标明，在转机性克隆早期播散后，PT独到和MT-独到的亚克隆突变连续集会，导致PT和MT之间的遗传谱存在各异。

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图S4

5、转机内异质性讲述了免疫逃跑的进化

由于进化瓶颈，MT被以为比PT更同质；MSK-MET推敲标明，大无数癌症在MT中更均匀（图5A）。可是，在包括HCC在内的少数癌症中，MT与PT一样具有异质性（图5A和5B）。

与MSK-MET推敲一致，检会部队中的MT发达出与配对PT相似水平的亚克隆突变（图5C；S5A）。标明HCCMT中存在高基因组肿瘤内异质性（ITH）。

肿瘤特异性突变以新抗原的体式介导肿瘤免疫原性，新抗原ITH是PT免疫监视的高度接洽决定因素，在转机性疾病中，ITH对新抗原景不雅和造反肿瘤免疫敏锐性的影响仍未得到探索。

为了表征转机性HCC中的新抗原异质性，分析了34对MT进行了配对的多区域DNA和RNA测序的患者，悉数展望了13，308个潜在的新抗原（图S5B）。

为了推敲新抗原ITH在MT中的临床接洽性，将MT区域分为两组，具有不同的新抗原ITH阈值，通过亚克隆新抗原分数进行揣度，以幸免测序深度偏差（图5D）。发现具有高新抗原ITH的MT，与总生涯期显著镌汰接洽（图5E和S5C）。

新抗原ITH高的MT区域具有显著较低的克隆性新抗原负荷和较高的亚克隆性新抗原负荷，而组间新抗原总负荷莫得各异（图5F和S5E）。

分析新抗原ITH高和低MT之间肿瘤微环境（TME）免疫构成的各异。高新抗原异质性的区域发达出CD3，CD4，CD8和GranB细胞的浸润显著减少，况且CD45RO细胞趋于较少（图5G和S5H）。

TCR组库测序表示，在新抗原ITH高的区域，T细胞克隆率显著攻讦；这意味着T细胞的克隆扩增有限（图5H；S5I）。

这些分析标明高新抗原异质性与转机中抗肿瘤T细胞免疫功能失调接洽，这可能归因于新抗原耗竭或抗原加工和呈递机制（APM）的破碎。为了差异这两种可能性，作家一一区域绘画了它们的发生区域（图5I）。

领先哄骗不雅察到/预期的新抗原比率来量化每个转机区域的DNA免疫裁剪进度，发现新抗原ITH高和低MTs的免疫裁剪评分无显赫各异（图5J）。与低新抗原ITHMT比较，在高新抗原ITHMT中更频频地不雅察到抗原呈递中断——通过东谈主类白细胞抗原杂合性缺失（HLA-LOH）和体细胞突变或编码APM因素的基因中的拷贝数丢失事件（图5K）。

接下来评估呈递机制（APM）破碎是从接种肿瘤细胞中遗传的照旧在定植后得回的。发现绝大无数APM颓势在MT配对的PT中不存在，标明癌细胞在转机接种后进化了这些事件（图5L；5M）。与莫得亚克隆APM颓势事件的配对区域比较，具有亚克隆APM颓势事件的区域对HLA-A卵白的染色彰着减少（图5N）。

总而言之，MTs在HCC中发达出更高水平的转机性异质性。高新抗原ITHMT在转机定植后跟着新抗原呈递功能防碍而进化，这可能会挫伤抗肿瘤T细胞免疫并导致不良临床结局。

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图5

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图S5

新金瓶梅什么时候上映6、HCC转机本事选用的SCNA

通过加权基因组不巩固性指数（wGII）预计，MTs比PTs具有更高的SCNA职守（图6A）。可是，PT和MT之间的肿瘤突变负荷（TMB）莫得显著各异（图S6A）。此外，肝外转机的PT显泄露显赫升高的wGII（图6B），而TMB在组间相似（图S6B）。

为了鉴定可能促进转机的潜在的大畛域基因组篡改，比较了每个事件在“选用”克隆和“未选用”克隆中发现每个SCNA的次数比例（图6C），发现3个局灶性SCNA缺构怨4个臂水平缺失在选用的克隆中显赫富集（图6D和6E）。

鉴于癌症转机流程中的多任务流程，任何一个选用的SCNA皆可能不及以完成整个这个词任务。因此，进一步通过将每个转机中选用的SCNA数目相加来生成转机富集SCNA（MetSCNA）的评分；与配对的PT比较，MTs显泄露显著更高的MetSCNA分数（图6F）。具有转机结局的PT的评分显著高于NRM组的PT。

具有较高MetSCNA评分的患者显泄露显著更短的转顷然分（异时性）、更差的无进展生涯期（图S6D；图6G-6H）。多变量分析表示，快速转机进展与MetSCNA评分之间的强接洽（图S6E）。

为了在功能上考据三个局灶性缺失的促转机作用，索要了142个位于这些片断中的基因。如若基因餍足以下法式，则保留基因进行进一步分析：（a）与莫得缺失的样本比较，在含有缺失的样本中显著下调，（b）与PT比较，在MT中下调，以及（c）与临床效用的显著关联。

最终保留三个基因（CHID1、RNH1和PNPLA2）用于功能考据测定（图6I和S6G）。构建巩固阻扰这三个基因抒发的东谈主HCC细胞系，并鉴定其体内转机后劲，发现敲低CHID1和RNH1显著加多转机发生率和职守（图6J、6K、S6H和S6I）。

综上，推敲团队鉴定了可能导致HCC转机进展的大家wGII和7个候选SCNA，救援了赋予癌细胞转机后劲需要宏不雅进化飞跃的假设。

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图S67、在转机进展流程中未遴荐亚克隆Wnt接洽突变

进一步表征转机进展流程中驱动突变的进化遴荐，发现除了TP53和CPS1以外，HCC特异性驱动因素上的大无数亚克隆突变皆莫得被遴荐（图7A），泛癌驱动因素也发达出雷同的“未遴荐”阵势（图S7A）。

在13个“未遴荐”的亚克隆驱动突变中，有4个基因（CTNNB1、AXIN1、APC和NCOR1）参与致癌Wnt通路。IHC进一步证实了“未转机”亚克隆中Wnt信号转导的激活（图7B）。

突出是，转机流程中未遴荐Wnt接洽突变仅适用于亚克隆突变，不适用于克隆突变。

这些效用标明，在进展到转机本事，亚克隆Wnt突变的进化能源学阵势是“未遴荐的”。

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8、来自MT配对PT的Wnt野生型区域含有富含癌症接洽成纤维细胞的反馈性TME，成心于转机性播散

连续推敲在具有或不具有Wnt接洽突变的亚克隆之间不雅察到的彰着遴荐性转机上风的机制。

MET组的整个PT区域中分为两个亚型。具有四个频频突变的Wnt接洽基因之一的区域定为Wnt突变（Wnt-mut），而莫得上述突变的区域定为Wnt野生型（Wnt-wt）（图7C）。单样本GSEA和IHC证实Wnt-mut区域的特征是Wnt卑鄙基因的抒发显著升高（图S7C）和GS染色（图S7D），意味着激活的Wnt信号转导。

各异抒发分析鉴定Wnt-mut和Wnt-wt区域之间显著上调/下调基因；GO和GSEA表示Wnt-mut区Wntβ-catenin信号、代谢的激烈富集，而Wnt-wt区富集于免疫应酬、CAF激活、上皮-间充质滚动（EMT）和血管生成（图7D和S7E）。

介导TME互相作用的细胞因子在Wnt-wt区域显赫上调（图S7F）。为了讲述Wnt-wt肿瘤细胞中细胞因子抒发升高的机制，分析了TCGA-LIHCATAC-seq数据，发现NF-κB-p65基序在Wnt-wt特异性染色质峰中排行第二（图S7G）。

使用代表Wnt-wt（MHCC97H细胞）和Wnt-mut（MHCC97H细胞上的AXIN1敲除）的细胞系模子进行了转录组分析和ATAC-seq测定。

发现NF-κB通路卑鄙的基因在Wnt-wt细胞中表示上调（图S7H）。NF-κB基序在Wnt-wt细胞特异性的灵通染色质区域中彰着富集（图S7I和S7J）；在Wnt-wt细胞中的NF-κB转录活性高于Wnt-mut细胞（图S7K）；Wnt-wt区域的免疫细胞和基质细胞浸润更大（图S7L）。

综上，Wnt-mut和Wnt-wt区域之间高度不同的基因抒发谱标明其肿瘤生态系统存在根柢各异。

为了认识肿瘤生态系统的细胞构成，哄骗15个符号的IHCpanel，然后进行数字病理学分析。Wnt-wt区域具有较高的TME细胞性（图7E和S7M），况且其特征在于对CAF激活记号物（图7E和S7N）、更大效应CD8+T细胞染色、免疫阻扰信号和阻扰性免疫细胞类型（颐养性T、髓源阻扰细胞）（图7E）。

为了破译细胞和抒发方法在多细胞群落中的空间组织面目，使用NanostringGeoMx东谈主类全转录组图谱对团结肿瘤内共发生的Wnt-mut和Wnt-wt区域进行了数字空间分析（DSP）（图7F）。

DSP数据的反卷积表示细胞毒性评分莫得各异，但CD8中临了缺少T细胞评分显著升高（图7G和S7P）。来自Wnt-wt区域的CAFAOI发达出肌成纤维细胞CAF攻讦，但炎症CAF特征加多（图7G）。

总而言之，Wnt-mut和Wnt-wt区域代表了不同的区域免疫和基质环境。Wnt-mutTME含有较少的免疫细胞和基质细胞；Wnt-wt区域的特征是富含CAF、缺少T细胞和免疫阻扰的TME。

进一步分析恶性细胞和各式TME细胞之间的互相作用，发现CAF和恶性细胞显泄露最强的细胞互相作用（图7I）。

进行癌细胞系-CAF和患者起头的类器官（PDO）-CAF共培养测定（图S7R）。遴荐具有高转机后劲且无Wnt接洽突变的HCC细胞系MHCC97H动作Wnt-wt恶性细胞模子。构建了AXIN1敲除（KO）MHCC97H细胞系以模拟Wnt-mut细胞（图S7S和S7T）。

斥地了PDO模子，并从5个具有遗传阐明的Wnt突变气象的HCC标本中索要了CAF（图S7U）。发现MHCC97H-wt细胞发达出显著更高的CAF召募才调（图7J和S7V）；成纤维细胞活化的枢纽介质在MHCC97H-WT细胞中的抒发显著更高（图7K）。Wnt-wtPDO召募的CAF彰着多于Wnt-mutPDO（图7L和S7V）。

总之，Wnt-wtHCC区域似乎含有富含活化成纤维细胞的反馈性TME，通过激活EMT方法赋予Wnt-wt癌细胞更强的转机播散才调（图S7W）。

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9、Wnt-wt mt免疫阻扰B细胞富集并通过CD94-NKG2A轴介导CD8+ T耗竭

对转机性HCC标本进行单细胞测序（图8A，S8B和S8C），鉴定了几种T细胞、当然杀伤细胞、B/浆细胞和多个骨髓亚群（图S8D-S8G）；见一步分析CD8+T细胞分化轨迹，并在Wnt-mut和Wnt-wtMT组间比较（图8B-8C；S8H）。

效用发现，T细胞分化轨迹很猛进度上取决于其Wnt气象，起头于Wnt-mutMT的CD8+T细胞主要位于轨迹的中央段（图8C和S8G）。相悖来自Wnt-wtMT的CD8+T细胞严重偏向轨迹结尾，其特征是临了销耗的T细胞（图8C和S8G）。

此外，Wnt-wtMT中B浸润的倾向彰着（图8B和S8J）；scRNA-seq数据的无监督聚类表示五个不同的B细胞簇（图S8E）；值得留神的是，挂牵B细胞抒发更高的B细胞接洽分子，标明免疫阻扰表型（图8F）。

随后，CellChat推断了挂牵B细胞和整个免疫细胞之间假设的配体-受体互相作用，发现挂牵B细胞与CD8Term的互相作用权重最高（图8G）。

进一步的表征表示，在Wnt-wtMTs的配景下，HLA-E:CD94-NKG2A是挂牵B细胞和CD8Term之间最显赫的配体-受体对（图8H）。

效用标明免疫阻扰性B细胞可能通过指导CD8的临了缺少来挫伤抗肿瘤免疫力+Wnt-wtMT中的T细胞。为了考据这个论断，进行CD8+ILs和HLA-E+或HLA-E-肿瘤浸润B细胞(TIBs)的共培养实践，发现HLA-E+TIBs显赫攻讦CD8+TIBs的脱颗粒才调，并指导了CD8+TILs的耗竭(图8O；S8K)。

此外，与HLA-E+B细胞共培养时，NKG2A阻断(monalizumab)有用地复原了CD8+TILs的细胞毒性才调，并显赫攻讦了最终销耗的CD8+TILs的比例(图8P和S8L)。

总而言之，Wnt-wtmt发达出免疫阻扰B细胞的浸润加多，通过HLA-E:CD94-NKG2A互相作用导致CD8+TILs的耗竭。靶向这种互相作用的政策，具有转机性HCC疗养的后劲。

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转机性肿瘤克隆进化+单细胞扫码研讨

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